9月18日，中国科学院上海营养与健康研究所翟琦巍研究组在国际学术期刊Nature Communications在线发表了题为“Discovery of the major 15-30 nt mammalian small RNAs, their biogenesis and function”的研究论文。该研究通过生化分析、新型高通量测序等多种分析鉴定技术，发现了哺乳动物中长度为15-30个碱基(Nucleotide, nt)范围内的主要的小RNA是3’环磷酸小RNA，初步揭示这些3’环磷酸小RNA的产生机制，并发现其可以存在于Ago2复合物中，以类似于microRNA的方式结合到mRNA的3’非翻译区(3’-UTR)从而引导目的mRNA的降解，进而发挥生物学功能。该项研究拓展了对哺乳动物小RNA的认识，揭示了哺乳动物中15-30nt长度范围内的大部分未知小RNA，特别是环磷酸小RNA，初步揭示其产生机制，并发现其具有类似microRNA的重要生物学功能。
小RNA是一类生物体内具有重要生物学功能、通常长度小于200nt的RNA。目前在15-30 nt长度范围内已经发现了多种类型的小RNA，例如microRNA、piRNA、tRNA-derived small RNA (tsRNA)以及small rDNA-derived RNA (srRNA)等。然而，这些小RNA是否是15-30 nt长度范围内的主要小RNA还并不清楚。
研究人员使用小鼠肝脏分离纯化了大量的15-30nt长度的小RNA，让这些小RNA通过常规的电泳染色就能清晰观察到。随后，通过T4 RNA ligase 2催化的3’羟基(3’-OH)小RNA与5’预腺苷化接头的连接反应，发现这些15-30nt长度的小RNA绝大多数并不是3’-OH；仅当使用T4多聚核苷酸激酶(T4 Polynucleotide Kinase, T4 Pnk)催化处理后，才能几乎全部被连接上接头。进一步的质谱分析及大量不同细胞或组织的多种生化分析发现，哺乳动物15-30nt长度的小RNA的3’末端主要为环磷酸(2’,3’-cyclic phosphate, 2’,3’-cP)，含量约为90%，这些小RNA可以称为3’环磷酸小RNA (sRNAs with 3’-cP, sRNA-cP)。为了进一步解析这些sRNA-cP，研究人员建立了一种可以在一个样品中同时检测sRNA-OH和sRNA-cP的新型高通量测定小RNA序列信息的方法，称为TANT-seq (T4 Rnl2/AP/NaIO4/T4 Pnk (3’ phosphatase minus)/RtcB-based sRNA-seq)。基于TANT-seq高通量测序，揭示了大量的sRNA-cP和sRNA-OH的序列信息，并发现sRNA-cP和sRNA-OH通常具有不同的序列。
为了便于分析不同3’末端的小RNA，研究人员建立了一种可以同时检测3’-OH、3’-P和3’-cP的基于定量PCR的技术方法TE-qPCR (triplex-3’-end qPCR)。基于TE-qPCR技术方法对许多sRNA-cP和sRNA-OH进行了验证，并发现很多sRNA-cP和饥饿、肥胖、糖尿病等生理病理状态有关，提示sRNA-cP有重要的生物学功能。
哺乳动物15-30nt长度的小RNA主要为sRNA-cP，但这些小RNA究竟是在分离纯化RNA过程中随机降解产生的，还是在细胞内特异性加工产生的还有待解答。通过对sRNA-cP的末端序列特征分析发现，其3’末端主要为嘧啶碱基，而5’末端主要为嘌呤碱基。根据已知的细胞内各种RNA内切酶的序列识别特征，通过逐步的体外筛选以及后续的基因敲除和过表达等技术发现，ANG和RNase4介导了部分sRNA-cP的产生。
有研究报道microRNA、tsRNA、srRNA、snoRNA、snRNA、sinRNA、smRNA、piRNA、srpRNA以及smcRNA等小RNA都可以和Ago2结合，特别是microRNA已经被广泛报道可以通过和Ago2结合靶向目标mRNA的3’非翻译区从而降解目标mRNA或抑制其翻译。哺乳动物15-30nt长度的主要小RNA sRNA-cP是否也可以类似于microRNA和Ago2结合，从而发挥生物功能呢？研究人员通过免疫沉淀获得了Ago2复合物，随后抽提获得了Ago2复合物中的RNA，并通过TANT-seq测序分析了其中的小RNA。研究发现Ago2复合物中，最主要的15-30nt小RNA也是sRNA-cP，含量约为80-90%，而microRNA仅占sRNA-OH的约10%，相当于Ago2复合物中sRNA-cP的含量大约为microRNA的近100倍。Ago2中这么大量的sRNA-cP，如果大部分都能发挥生物学功能，其作用和意义甚至有可能会高于microRNA。
为了研究这些Ago2复合物中的sRNA-cP的生物学功能，研究人员参考microRNA进行了生物信息学预测，通过荧光素报告基因筛选了一系列可能靶向的3’-UTR。从40个候选sRNA-cP预测的107个靶向的3’-UTR中，筛选出16个sRNA-cP和对应的18个3’-UTR正反向都能有两倍以上的调控效应。进一步的研究发现其中大部分都能正反向有效调控相应的mRNA水平，并且其中有些还进一步验证了相应的正反向的对于蛋白表达水平的调节作用。其中发现的snR-2-cP可以通过依赖于Ago2的方式，靶向著名的抗凋亡基因Bcl2的mRNA的3’-UTR靶位点，下调Bcl2的mRNA和蛋白水平，从而调控细胞凋亡。
为了进一步验证sRNA-cP是否可以结合Ago2并引导识别和剪切靶序列，研究人员分离纯化转染了特定小RNA的Ago2复合物，在体外添加相应的小RNA识别的靶序列。在该体外研究体系中可以清晰观察到sRNA-cP可以序列特异性地引导对于靶序列的识别和剪切，并且对于靶序列的剪切位置与microRNA一致，都发生在与小RNA互补的靶序列的第10和第11个碱基之间。此外，通过直接分离纯化Ago2复合物，在体外添加相应的小RNA和小RNA识别的靶序列，也发现具有相一致的效果。进一步研究发现，sRNA-cP发挥作用时不依赖于其3’-cP。
该研究工作开辟了小RNA研究的新方向，为后续大量sRNA-cP的生理病理相关性及其生物学功能揭示奠定了基础，也将对整个小RNA研究领域产生重要影响，有望成为分子生物学领域的里程碑性工作。
中国科学院上海营养与健康研究所赖和劲博士和冯宁博士为该论文共同第一作者。翟琦巍研究员为该论文的通讯作者。该研究工作得到了科技部国家重点研发计划、国家自然科学基金委、中国科学院战略性先导科技专项、中国科学院前沿科学重点研究项目和上海领军人才项目等的资助，也获得了中国科学院上海营养与健康研究所公共技术平台和动物平台的支持。
哺乳动物15-30nt主要小RNA的分析鉴定及其产生机制和功能的示意图
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